Diagnóstico Molecular

Diagnóstico molecular é um nome genérico para um conjunto de técnicas que utilizam o DNA como material para detectar doenças genéticas, identificar pessoas (criminosos ou cadáveres) e determinar paternidade ou graus de parentesco.

Embora sejam técnicas muito atuais, os fundamentos e ferramentas básicas foram começaram a ser descobertas e utilizadas desde o final dos anos 60 e início dos anos 70.

Três pesquisadores, Werner Arber (n. 1931) e os norte-americanos Daniel Nathans (1928-1999) e Hamilton Smith (n.1931), elucidaram o mecanismo de ação das enzimas de restrição. Estas enzimas são capazes de reconhecer sequências específicas de DNA e clivar (cortar) a molécula. Tais enzimas são isoladas a partir de bactérias que as utilizam como mecanismo de defesa contra DNAs invasores (como DNAs de vírus). Veja abaixo que uma sequência específica (GAATTC) foi cortada pela enzima de restrição.

O DNA dentro de uma mesma espécie varia muito pouco. Porém, este pouco já traz diferenças suficientes para distinguirmos um indivíduo do outro. Assim, se utilizarmos enzimas de restrição para cortarmos o DNA de duas pessoas diferentes, obteremos diferentes resultados.

Existem duas técnicas que utilizam as enzimas de restrição:

a) RFLP - Polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição.

Mutações podem alterar o DNA entre um sítio de clivagem e outro. Isto gera diferentes formas (polimorfismos) do mesmo trecho de DNA como podemos observar na figura abaixo.

Na primeira raia (da direita para a esquerda) temos uma pessoa normal. Tal indivíduo possui os dois fragmentos (alelos) do mesmo tamanho. Já na segunda raia, temos um indivíduo com um alelo sadio e o outro com a mutação (portador). O terceiro possui os dois alelos mutados.

Podemos fazer o estudo de doenças genéticas e sua distribuição em famílias como mostra a figura abaixo.

b) VNTR - Número variável de repetições em série.

Existem sequências que se repetem no nosso genoma. O número de repetições pode variar de pessoa para pessoa (ver figura abaixo) e segue um padrão de herança mendeliana como veremos a seguir.

Ao reconhecer sítios com pedaços de DNA com variados números de cópias em série, podemos distinguir duas pessoas e, inclusive utilizar em um exame de paternidade (como podemos observar na figura abaixo).

Hoje em dia, além destas técnicas temos várias técnicas baseadas no PCR. O PCR ou reação em cadeia da polimerase foi desenvolvida em 1983 por Kary Mullis. É baseada no princípio de amplificar, ou seja, aumentar a quantidade de DNA a partir de uma pequeníssimas quantidades.

Mas como funciona isto? Primeiro extraímos o DNA de um indivíduo, depois purificamos e processamos em uma reação esquematizada abaixo.

Para processar o DNA utilizamos uma máquina, o termociclador, para controlar os ciclos de:

a) desnaturação - quando as fitas do DNA se abrem.

b) anelamento - quando pedaços específicos de DNA se "grudam" (anelam-se) ao DNA.

c) extensão (ou síntese de nova molécula de DNA)

Estes cíclos se repetem e aumentam a quantidade (amplificam) do DNA inicial em uma Progressão Geométrica (1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512, 1024 moléculas...)

Esta técnica tem sido usada para variadas finalidades além de exames de paternidade e criminalística. Existem doenças, por exemplo, que são causadas por parasitas que não são detectados por exames de rotina. Recorre-se então ao PCR para detectar uma sequência de DNA presente apenas no parasita (bactéria ou protozoário).

As técnicas discutidas aqui podem ser utilizadas combinadas para diferentes finalidades.